在这一节中，我们将学习如何:
| • | 使用细胞孔门来查看单细胞孔和多细胞孔对应的二维绘图中的事件 |
| • | 创建热图叠加图层，用以在一个图上查看多个细胞孔中的事件 |
我们将使用一个数据集，来查找FL2-A呈阳性的细胞孔。我们将使用HighContentAnalysis.fey版面以及HighContent96wellData.dns数据文件(.dns是FCS Express创建的一种特殊文件格式)。原始数据集中有96个FCS文件，这些文件是从一个基于细胞板的采集系统中获得的。
| 1. | 请导入HighContentAnalysis.fey版面。 |
| 2. | 请选择Data(数据)→Organize Data Sets(组织数据集)→Data List(数据列表)命令。 |
| 3. | 请点击 图标，把数据文件添加到数据列表中。 |
| 4. | 请从Files of type:(文件类型:)下拉列表中选中DNS data Stream files(DNS数据流数据) (*.dns)(图T18.17)。 |
图T18.17 Choosing DNS Data Stream Files (选中DNS数据流文件)
| 5. | 请来到FCS Express Sample Data(FCS Express样本数据)目录(图T18.18)。 |
图T18.18 Choosing the HighContent96wellData.dns File (选择HighContent96wellData.dns文件)
| 6. | 请选中"HighContent96wellData.dns"文件(图T18.18)。 |
这时这个文件会出现在数据列表中。这个文件包含从96个细胞孔中获得的、以.dns格式存储的数据。在我们插入热图之前，我们要把这些数据导入到版面中的绘图里。
| 8. | 请选择Data(数据)→Change Data on All Objects(修改所有对象上的数据)→Select(选中)命令。 |
| 9. | 请选中Data List(数据列表)标签卡。 |
| 10. | 请选中HighContent96wellData.dns文件。 |
这时绘图看起来应该如图T18.19。
图T18.19 High Content Analysis Layout after Loading HighContent96wellData.dns File (在导入HighContent96wellData.dns文件后的高涵量分析版面)
版面中的彩色点状图显示了.dns文件中的所有数据(图T18.19)。二维绘图中有一个Live Cells(活细胞)门，热图中仅仅显示这个门中的细胞。
热图中FL2-A参数对应的"热"孔显示为红色，"冷"孔显示为绿色。不同程度的热度由从红到黑到绿的过渡色代表。
我们现在要在热图上应用门。
| 13. | 请从弹出菜单上选中Create Gate(创建门)→Well(细胞孔)。 |
| 14. | 请点击细胞板边缘(但实际在绿色选框中)的空白区域，如图T18.20中的光标所示(点击一个细胞孔将直接把该孔选为门操作的对象)。 |
图T18.20 Creating a Well Gate (创建细胞孔门)
这时会出现Editing New Well Gate(编辑新的细胞孔门)对话框(图T18.21)。
图T18.21 Editing a New Well Gate (编辑新的细胞孔门)
| 15. | 请点击编号为H12的门。这时会出现Create New Gate(创建新门)对话框。 |
| 16. | 请输入"Negative Control(阴性对照)"作为门的名字。 |
| 19. | 请选中Gating(门操作)→Create Gates(创建门)→Well(细胞孔)命令(图T18.22)。 |
图T18.22 Selecting the Create Well Gate Command (选中创建细胞门命令)
| 20. | 请直接点击A4孔。这时会出现Create New Gate(创建新门)对话框。 |
| 21. | 请输入"Experimental(实验)"作为门的名称。 |
| 23. | 请把"阴性对照"和"实验"两个门拖到"Live Cells(活细胞)"门上，在门视图上创建一个子门结构层次。 |
这时的版面以及门视图看起来应该如图T18.23所示。
图T18.23 Layout with Gate View Indicating Hierarchical Gating of the Negative Control and Experimental Gates (版面中的门视图显示"阴性对照"以及"实验"门的层次结构)
我们现在要创建一个柱状图叠加图层来查看不同细胞孔中的数据。
| 24. | 请把热图拖向版面中名为Histogram for Heat Map data(热图数据对应的柱状图)的柱状图上。这将在柱状图上显示和热图中完全相同的数据。 |
| 27. | 请选择Overlays(叠加图层)类别选项。 |
在叠加图层列表中有两个叠加图层，它们对应着相同的FCS细胞板文件夹文件。
| 29. | 请把Gate(门)修改为"Negative Control(阴性对照)"。 |
| 30. | 请在Line Options(线条选项)下把Color(颜色)修改为绿色。 |
| 32. | 请把Gate(门)修改为"Experimental(实验)"。 |
| 33. | 请在Line Options(线条选项)下把Color(颜色)修改为蓝色。 |
这时的柱状图应该看起来如图T18.24所示，其中"Negative Control(阴性对照)"门中的细胞显示为绿色，"Experimental(实验)"门中的细胞显示为蓝色。
图T18.24 Histogram Displaying Events from Well Gates (显示细胞孔门中的柱状图)
我们现在要标记这些细胞孔门，以选中不同的细胞孔。
| 36. | 请从弹出菜单上选中Edit Gate(编辑门)→Experimental(实验)。这时会出现Editing(编辑)细胞孔门对话框，A4细胞孔同时也被高亮显示为蓝色(图T18.25)。 |
图T18.25 Editing the Experimental Well Gate (A4) (编辑"实验"细胞孔门(A4))
注意到"实验"柱状图中的数据峰有些移动，因为它显示的是新选中的门(细胞孔)中的细胞(图T18.26)。
C12细胞孔的FL2-A染色不是很均匀，而那些比较"冷"的细胞孔的染色(例如G9，请点击G9来查看染色)和阴性对照有交叠。我们现在来选中几个"阴性的"细胞孔来在柱状图上更好地查看阴性细胞群。
图T18.26 Experimental Well Gate Changed to C12 (C12被选为"实验"细胞孔门)
| 38. | 请在细胞孔门的Editing(编辑)窗口中点击Close(关闭)。 |
| 39. | 请在键盘上按下Ctrl+Z，撤销对门的修改。 |
| 41. | 请从弹出菜单上选择Edit Gate(编辑门)→Negative Control(阴性对照)。 |
| 43. | 请点击细胞孔C1和F1(图T18.27)。 |
图T18.27 Selecting Multiple Non-consecutive Wells (C1, F1, and H12) (选中多个位置不连续的细胞孔(C1、F1和H12))
用户可以用这种方式选中多个位置不连续的细胞孔。注意到柱状图进行了相应的更新来显示选中的多个细胞孔(图T18.27中的C1、F1以及H12)。我们现在要用一个选框来选择多个细胞孔。
| 46. | 向左下方拖动鼠标，选中B1-F1。注意到一个选框的出现，显示选中了哪些细胞孔(图T18.28)。 |
图T18.28 Selecting Multiple Continuous Wells (选中多个连续的细胞孔)
用户也可以通过使用画选择框结合"Ctrl+点击"的方式来同时选中多个细胞孔。
| 50. | 请点击G9细胞孔，将其选中(请不要松开Ctrl键)。 |
| 51. | 请创建一个选择框(请仍不要松开Ctrl键)，选中A8-A11。 |
| 53. | 请从Editing Well Gate(编辑细胞孔门)上点击Close(关闭)。 |
现在选中了细胞孔B1-F1、A8-A11以及G9，它们一起被显示在了柱状图中的阴性对照峰上(图T18.29)。
图T18.29 Multiple Well Selection (选中多个细胞孔)
用户也可以用相同的方式，取消对细胞孔门的选择。
| 55. | 请从弹出菜单上选中Edit Gate(编辑门)→Negative Control(阴性对照)。 |
| 56. | 请右键点击细胞孔A8。注意到这个细胞孔门已经被删除了。 |
| 57. | 请通过Ctrl+拖拽的方式在细胞孔B1-F1上画一个框。这些连在一起的细胞孔门也将被删除。 |
虽然选中细胞孔进行门操作或把细胞孔显示在柱状图和二维绘图上非常有用，但是很多用户仍想知道哪些细胞孔有着较高的通道值。我们现在就来对热图进行格式化，只显示那些在某一阈值之上的细胞孔。
| 58. | 请选择名为"Histogram for Creating Threshold Value(用来创建阈值的柱状图)"的柱状图。 |
| 59. | 请选中Data(数据)→Change Data on Selection(修改选中的数据)→Select(选择)命令。 |
| 60. | 请选择Data List(数据列表)标签。 |
| 61. | 请选中High Content Flow Plate Data(高涵量流式孔板数据)文件。 |
| 65. | 请选中Heat Map(热图)→Colors Levels(颜色层次)类别选项。 |
| 66. | 请从下拉窗口中把Style(样式)修改为Threshold(阈值)。 |
| 67. | 请在Threshold Value(阈值)字段中点击 图标，插入一个标记。 |
| 68. | 请在Insert a Token(插入标记)对话框中双击Statistic(统计)。 |
| 69. | 请在Select a plot(选择绘图)列表框中选中"Histogram for Creating Threshold Value"绘图。 |
| 70. | 请在Create Statistic(创建统计)对话框的左侧选中Statistic(统计)类别选项。 |
| 71. | 请从Gate(门)下拉列表中选中Live Cells(活细胞)。 |
| 72. | 请在Statistic(统计)列表框中选中Median(中间数)。 |
| 74. | 请把Above Threshold Color(阈值以上的颜色)改为红色。 |
这时的热图应该看起来如图T18.30所示。红色代表细胞孔中FL2-A的荧光强度中间值高于整个细胞板的荧光强度中间值。
图T18.30 Threshold Defined as Median Value (阈值定义为中间值)
在下一节中，我们将批量分析多个细胞板。
