导入、插入以及格式化热图 |
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在这一节中，我们将学习如何:
| • | 以FCS细胞板文件夹的格式导入数据 |
| • | 插入热图 |
| • | 修改热图的方向 |
| • | 选择要在细胞孔中显示的统计和参数 |
| • | 修改热图的颜色层次 |
| • | 调整颜色的样式 |
| • | 仅仅在热图中显示门中的事件 |
我们将使用位于教程样本数据库中的HighContentFormatting.fey版面。这个版面中有一个在本节末尾时要使用的二维绘图。
在本节中，用户将要学习如何导入一个基于96孔板实验的文件夹。FCS Express可以处理细胞板中任意数目和任意排列方式的细胞孔。我们将要使用的数据在教程样本数据库中。为方便起见，这里只包括了一行零一个细胞孔对应的数据。
要导入大多数类型的96孔板流式数据，用户必须选中所有从细胞板那里获得的数据文件，而非只是其中的一个数据文件。
| 1. | 请从教程样本数据库中导入HighContentFormatting.fey版面文件。 |
| 2. | 请选择Data(数据)→Organize Data Sets(组织数据集)→Data List(数据列表)命令。 |
| 3. | 请点击 图标，把数据文件添加到数据列表中。 |
| 4. | 请从Files of type:(文件类型:)下拉列表中选择FCS Plate folder(FCS细胞板文件夹)(图T18.1)。 |
图T18.1 Choosing FCS Plate Folder from the Files of Type: Drop-down List (从"文件类型:"下拉列表中选择FCS细胞板文件夹)
| 5. | 请来到教程样本数据库中的High Content Flow Plate Data(高涵量流细胞板数据)文件夹(图T18.2)。 |
图T18.2 Choosing the High Content Flow Plate Data Folder (选中高涵量流式孔板数据文件夹)
| 6. | 请在文件夹上单击一次。请不要进入文件夹，因为我们想要选中文件夹中所有内容。 |
| 7. | 请点击Open(打开)。 |
这时这个文件夹会作为一个文件出现在数据列表中。这个文件包括.FCS文件以及细胞板中所有细胞孔中的数据。
注: 要想让FCS Express认出进行分析的细胞板的设置(也即是24孔、48孔、96孔还是384孔)，文件夹中必须有一个定义细胞板的文件。在这个例子中，这个文件已经在样本文件夹中了，其名称是"plate.AllExtraKeywords.txt"。这应用了FCS Express中的一个特殊功能；用这个功能用户可以在一个文件中插入额外的关键字而无需修改这个文件。详细内容请参见FCS Express用户手册中的第17.2节额外关键字。
| 8. | 请选择Insert(插入)→Other Plots(其它绘图)→Heat Map(热图)。 |
| 9. | 请在版面中用户想要插入热图的地方点击。 |
| 10. | 请点击Select a Data File(插入数据文件)对话框中的Data List(数据列表)标签(图T18.3)。 |
图T18.3 Choosing a Data File from the Data List Tab (从数据列表标签中选择一个数据文件)
| 11. | 请双击High Content Flow Plate Data(高涵量流细胞板数据)来选中数据文件夹。 |
| 12. | 请点击OK。 |
这时在版面上会出现一个热图，如图T18.4所示。这个热图仅仅显示了细胞孔A1-12和B1，因为我们在样本数据中仅仅包括了这些细胞孔。在这组数据集中我们关心的参数是FL2-A。我们现在就来修改数轴来显示这个参数。
图T18.4 Inserted Heat Map (插入的热图)
| 13. | 请点击细胞板行编号旁边的数轴参数(图T18.5)。 |
图T18.5 Changing the Heat Map Parameter (修改热图参数)
| 14. | 请从弹出菜单上选择FL2-A。 |
注意: 以上绘图中的颜色反映了热图中每个细胞孔对应的FL2-A通道上的算术平均。在本节稍后的内容里我们将演示如何修改绘图中的统计。
我们现在要为这个热图做个副本，然后修改新建热图的方向。
| 15. | 请选中该热图。 |
| 16. | 请选择Home(主页)→Clipboard(剪切板)→Duplicate 2D Plot(为二维绘图做副本)。(另外的方法是使用复制和粘贴命令)。这时在版面上会出现原始热图的一个副本。请调整这两个绘图的位置，使它们看起来如图T18.6所示。 |
图T18.6 Duplicate Heat Maps (为热图做副本)
| 17. | 请右键点击版面右侧新创建的热图 。 |
| 18. | 请从弹出菜单上选择Format(格式)。 |
| 19. | 请选择Heat Map(热图)→Heat Map Specific Options(热图特有选项)。 |
| 20. | 请把绘图的方向从Landscape(横向)改为Portrait(纵向)(图T18.7)。 |
图T18.7 Changing Orientation from Landscape to Portrait (把绘图方向从横向修改为纵向)
这时版面看起来应该如图T18.8所示。用户可以根据实验版面或显示/发表需要来修改热图的方向。
图T18.8 Heat Maps Displayed in Landscape and Portrait Modes (横向和纵向显示的热图)
我们现在要修改热图中颜色代表的统计数据。
| 21. | 请按下Ctrl+Z来撤销对绘图方向的修改。 |
| 22. | 请右键点击左边绘图。 |
| 23. | 请从弹出菜单上选择Format(格式)。 |
| 24. | 请选择Overlays(叠加图层)类别选项。 |
热图现在显示的是细胞孔中所有事件的算术平均值，如Statistic to show(要显示的统计)字段中显示的那样。
| 25. | 请从Statistic to show(要显示的统计)下拉列表中把要显示的统计改为Median(中间数)(图T18.9)。 |
图T18.9 Changing the Statistic to Show in the Heat Map (修改在热图中要显示的统计)
| 26. | 请点击OK。 |
这时版面应该看起来如图T18.10所示。注意到左边的绘图现在有一个非常明显的"热"孔A4。在这个例子中，中间数(左图)比算术平均(右图)能更好地区分"热"孔(红色)和"冷"孔(绿色)。
图T18.10 Heat Maps Displaying Statistics for Median (Left) and Arithmetic Mean (Right). (显示中间数(左图)和算术平均(右图)的热图)
我们现在将要调整热图中的颜色层次，这在显示热图和把阳性样本与阴性样本区分开来时是非常有用。
| 27. | 请右键点击左边绘图。 |
| 28. | 请从弹出菜单上选择Format(格式)。 |
| 29. | 请选择Heat Map(热图)→Color Levels(颜色层次)类别选项。 |
| 30. | 请在Selected Color Level(选中的颜色层次)下拉列表中选中Rainbow(彩虹)(图T18.11)。 |
图T18.11 Changing the Color Level of a Heat Map (修改热图的颜色层次)
| 31. | 请点击Preview(预览)。 |
请把格式化对话框移到旁边，这样用户可以观察热图的变化。请把颜色层次分别改为Green-Red(绿-红)、Green-Blue(绿-蓝) 、Greyscale(灰度图)以及Inverse Greyscale(反向灰度图)，以观察它们的不同。颜色层次中的Threshold(阈值)选项将为所有超过该阈值的细胞孔指定一个颜色。我们现在要键入一个阈值来参考这一功能(图T18.12)。
| 32. | 请在Selected Color Level(选中的颜色层次)下拉列表中选择Threshold(阈值)选项。 |
| 33. | 请在Threshold Value(阈值)字段输入"1000"。 |
| 34. | 请把Below Threshold Color(阈值以下的颜色)改为黄色。 |
| 35. | 请把Above Threshold Color(阈值以上的颜色)改为橙色。 |
图T18.12 Defining a Threshold to Display as a Color Level in a Heat Map (为热图中的颜色层次定义一个边界值)
| 36. | 请点击OK。 |
这时的热图应该看起来如图T18.13所示。那些FL2-A中间值在1000之上的细胞孔将显示为橙色，相反那些FL2-A中间值在1000之下的细胞孔将显示为黄色。
图T18.13 Heat Map with Threshold Color Level (热图对应的边界值颜色层次)
注: 请查看选择颜色主题一节来更多地了解如何为热图选择颜色。
我们现在要修改颜色层次的样式。"样式"在这里指的是如何用不同颜色显示热图中不同数值。默认的方式是"mean +/-SD(平均±标准偏差)"。该方法把细胞板上正好是所有细胞孔平均值的细胞孔指定为黑色。偏离平均值的细胞孔，根据它们是对平均值的正向偏离还是负向偏离，被指定为两个颜色中的一个。一个细胞孔的颜色与某一特定颜色的接近程度取决于用户定义的标准偏差值，默认情况下该值为3.5倍标准偏差。对于红-绿颜色层次，比平均值低三倍的细胞孔显示为绿色，比平均值高三倍的细胞孔显示为红色。在这个对话框中还有三个其它的选项: fixed range(固定范围)、percentile(百分比)以及threshold(阈值)。
| 37. | 请按下Ctrl+A，同时选中版面上的两个绘图。 |
| 38. | 请选中Format(格式)→Plot Options(绘图选项)→Overlays(叠加图层)命令。 |
| 39. | 请把Statistic to show(要显示的统计)修改为Median(中间数)。 |
| 40. | 请右键点击左边绘图。 |
| 41. | 请从弹出菜单上选择Format(格式)。 |
| 42. | 请选择Heat Map(热图)→Color Levels(颜色层次)类别选项。 |
| 43. | 请把Selected Color Level(选中的颜色层次)修改为 Green-Red(绿-红)。 |
| 44. | 请把Style(样式)从下拉列表中修改为Percentile(百分比)(图T18.14)。 |
图T18.14 Changing the Style of the Heat Map Color Levels (修改热图颜色层次的样式)
| 45. | 请点击OK。 |
| 46. | 请为右图重复第40步到第43步。 |
| 47. | 请把Style(样式)修改为Fixed Range(固定范围)(在右图上)。 |
| 48. | 请从Color Scaling(颜色范围)下拉列表中选择Logarithmic(对数)(在右图上)。 |
| 49. | 请点击OK。 |
这时的版面和热图看起来应该如图T18.15所示。注意到颜色层次随着Style(样式)从Mean +/- SD(平均±标准偏差)到Percentile(百分比)然后再到Fixed Range(固定范围)的变化而变化。
图T18.15 Adjusting Color Styles (调整颜色样式)
现在让我们把FCS细胞板文件夹中的数据导入到版面中的二维绘图中，然后在绘图上应用门，最后在热图上应用绘图来显示仅仅在门中的事件。
| 50. | 请选中标为"2D Plot for Gating"的绘图。 |
| 51. | 请选中Data(数据)→Change Data on Selection(修改选中的数据)→Select(选择)命令。 |
| 52. | 请选中Data List(数据列表)标签卡。 |
| 53. | 请选中High Content Flow Plate Data(高涵量流式细胞板数据)。 |
| 54. | 请点击Open。 |
| 55. | 请在二维绘图上应用图T18.16中所示的两个门。 |
图T18.16 A Gated 2D Plot Created from the High Content Flow Plate Data (一个应用了门的创建自高涵量流式孔板数据的二维绘图)
注: 因为上边的绘图未经过门处理，所以它显示出数据文件中所有细胞孔中的事件。
| 56. | 请选中左边的热图。 |
| 57. | 请从Gating(门操作)→Create Gates(创建门)→Current Gate(当前门)下拉列表中选中Gate 1(第1个门)。 |
| 58. | 请选中右边的热图。 |
| 59. | 请从Gating(门操作)→Create Gates(创建门)→Current Gate(当前门)下拉列表中选中Gate 2(第2个门)。 |
注意到热图现在仅仅显示门中的细胞。请试着移动一下门来观察热图的变化。
在下一节中，我们将分析热图中的数据。