FCS Express 4用户手册

选择自动拟合(单周期分析)

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选择自动拟合(单周期分析)

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选择自动拟合(单周期分析)

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对门进行设置来排除成对的细胞:

要排除成对的细胞，我们将检查DNA荧光信号的高度与DNA荧光信号的面积之间的二维绘图，然后在单个细胞事件上画门。很多时候用户也会使用DNA荧光信号的宽度与DNA荧光信号的面积之间的二维绘图。信号的高度与从DNA染料发出的荧光信号的峰值相对应。信号的面积是DNA染料发出的荧光信号峰下的计算面积。信号宽度代表DNA染料发出的荧光信号峰的时间。具体的激光束和其它设备条件将决定哪些参数最适合把单细胞与成对的细胞区分开来。在我们的例子中，DNA荧光面积信号对应的参数是FL2-A，DNA荧光宽度信号对应的参数是FL2-W，DNA荧光高度信号对应的参数是FL2-H。

如果用户已经打开了一个空白版面，请跳到第2步。

1.请选择 Application Button(应用程序按钮)→New Layout(新版面)。
2.请选中Insert(插入)→2D Plots(二维绘图)→Dot(点状图)命令。
3.请在空白版面内任何地方点击。

这时会出现Select a Data File(选择数据文件)对话框(图T19.1)。

4.请来到FCS Express Sample Data(FCS Express样本数据)文件夹中。
5.请选中BD.LMD.FCS文件(图T19.1)。
6.请点击Open(打开)。

 

图T19.1  Select a Data File Dialog (选择数据文件对话框)

图T19.1  Select a Data File Dialog (选择数据文件对话框)

 

这时版面上会出现一个点状图。

7.请点击x-轴，然后从弹出菜单上选择FL2-H。
8.请点击y-轴，然后从弹出的参数菜单上选择FL2-A。这时点状图应该看起来如图T19.2所示。

 

图T19.2  Dot Plot of FL2-H vs FL2-A (FL2-H与FL2-A形成的点状图)

图T19.2  Dot Plot of FL2-H vs FL2-A (FL2-H与FL2-A形成的点状图)

 

我们现在要在二维绘图上创建一个门来排除粘在一起的两个细胞以及那些看起来像是四倍体DNA的数据。我们要排除那些有高含量DNA的细胞，因为我们想要执行的是单循环DNA分析。以下步骤均针对图T19.3。要想了解如何创建门，请参见门操作教程一节。

9. 请选择FL2-H与FL2-A点状图。
10. 请选中Gating(门操作)→Create Gates(创建门)→Polygon(多边形门)命令。
11. 请创建一个如图T19.3中所示的多边形门。

这时会出现Create a New Gate(创建新门)对话框。

12. 请把门命名为"singlets HA"。

这时门应该看起来如图T19.3所示。

 

图T19.3  Gate to Exclude Doublets and Cells with High DNA Content (排除双细胞以及高DNA内容的细胞的门)

图T19.3  Gate to Exclude Doublets and Cells with High DNA Content (排除双细胞以及高DNA内容的细胞的门)

 

我们现在已经可以使用多周期软件包中的自动拟合功能来执行DNA细胞周期分析了。

插入多周期柱状图:

13. 请选中Insert(插入)→1D Plots(一维绘图)→Multicycle DNA(多周期DNA)命令(图T19.4)。
14. 请在版面上的空白区点击。

 

图T19.4  Selecting the Insert Muticycle DNA Command (选中插入多周期DNA命令)

图T19.4  Selecting the Insert Muticycle DNA Command (选中插入多周期DNA命令)

 

这时会出现Select a Data File(选择数据文件)对话框，如前图T19.1所示。

15. 请来到FCS Express Sample Data(FCS Express样本数据)文件夹。
16. 请选择BD.LMD.FCS文件(图T19.1)。
17. 请点击Open(打开)。

这时会出现Select DNA parameter(选择DNA参数)对话框，如图T19.5所示。以下步骤均针对图T19.5。

18. 请选择FL2-A作为参数，如图中的蓝色高亮所示。
19. 请从Gate(门)的下拉列表中选择"singlets HA"，如图中的光标所示。
20. 请点击OK。

 

图T19.5  Select DNA Parameter Dialog (选择DNA参数对话框)

图T19.5  Select DNA Parameter Dialog (选择DNA参数对话框)

 

应用singlets HA门的FL2-A柱状图经过使用自动拟合的多周期分析，如图T19.6所示。

 

图T19.6  MultiCycle Analysis of FL2-A Using Singlets HA Gate (对使用了Singlet HA门的FL2-A图进行多周期分析)

图T19.6  MultiCycle Analysis of FL2-A Using Singlets HA Gate (对使用了Singlet HA门的FL2-A图进行多周期分析)

 

我们现在将显示和多周期DNA分析相关的图例信息。

21. 请右键点击柱状图，调出相关弹出菜单。
22. 请在弹出菜单上选择Format(格式)。
23. 请从Formatting(格式化)对话框中选择Legend(图例)类别选项(图T19.7)。
24. 请点击Visible(可视)复选框。
25. 请点击OK(图T19.7)。

 

图T19.7  Formatting the DNA histogram to Display the Legend Associated with MultiCycle Analysis (格式化DNA柱状图来显示和多周期分析相关的图例)

图T19.7  Formatting the DNA histogram to Display the Legend Associated with MultiCycle Analysis (格式化DNA柱状图来显示和多周期分析相关的图例)

 

或者，可用Format Legend(格式化图例)命令来显示图例信息，方法如下:

•请单击柱状图，柱状图这时应该有一个绿色边框。

请选择Format(格式)→Plot Options(绘图选项)→Legend(图例)命令(图T19.8)。

 

图T19.8  Selecting the Format Legend Command (选择格式化图例命令)

图T19.8  Selecting the Format Legend Command (选择格式化图例命令)

 

这时会出现Formatting Legend(格式化图例)对话框(图T19.9)。

•请在Formatting Legend(格式化图例)对话框中单击Visible(可见)复选框。
•请点击OK。

 

图T19.9   Formatting Legend Dialog (格式化图例对话框)

图T19.9   Formatting Legend Dialog (格式化图例对话框)

 

这时和多周期DNA分析相关的图例会出现在柱状图的右侧(图T19.10)。

 

图T19.10  MultiCycle DNA Histogram Cell Cycle Analysis with Associated Legend (多周期DNA柱状图细胞周期分析以及相关图例)

图T19.10  MultiCycle DNA Histogram Cell Cycle Analysis with Associated Legend (多周期DNA柱状图细胞周期分析以及相关图例)

 

如你在图例中看到的那样，这个柱状图仅仅包括二倍体细胞，因此可以用多周期软件包的自动拟合功能来执行多周期分析。我们可以通过检测Ribbon条上的多周期信息来确认这一点。

26. 请左键点击柱状图将其选中，这时柱状图应该有一个绿色边框(图T19.10)。
27. 请选中Multicycle(多周期)标签卡(图T19.11)。

 

图T19.11  The Multicycle Tab (多周期标签卡)

图T19.11  The Multicycle Tab (多周期标签卡)

 

注意到Autofit(自动拟合)以及Model 1(模型1)被高亮显示为橙色(图T19.11)。这表明多周期拟合模型和模型1正被用来分析这个DNA柱状图。同时也注意到图T19.11中光标所指的单周期也被选中。

注: 要想了解不同模型之间的区别，请参考多周期软件包手册。

我们现在要来查看针对这个柱状图的所有统计选项。

28. 请右键点击柱状图，调出相关弹出菜单。
29. 请从弹出菜单上选中Statistics(统计)→DNA Cycle Statistics(DNA周期统计)(图T19.12)。

 

图T19.12  DNA Cycle Statistics Pop-up Menu Item (DNA周期统计弹出菜单选项)

图T19.12  DNA Cycle Statistics Pop-up Menu Item (DNA周期统计弹出菜单选项)

 

这时会出现当前模型(Model 1(模型1))对应的DNA Cycle Statistics(DNA周期统计)(图T19.13)。注意到用户可能有和在这里看到的不同的统计数值，因为用户的单细胞门可能和本节中绘制的门有所不同。

30. 请把DNA Cycle Statistics(DNA周期统计)窗口移到绘图的下方(图T19.13)。

 

图T19.13  DNA Cell Cycle Statistics from the MultiCycle Model 1 Analysis of the Histogram (柱状图多周期模型1分析给出的DNA细胞周期统计数据)

图T19.13  DNA Cell Cycle Statistics from the MultiCycle Model 1 Analysis of the Histogram (柱状图多周期模型1分析给出的DNA细胞周期统计数据)

 

31. 请右键点击柱状图，调出相关弹出菜单。
32. 请出弹出菜单上选中Statistics(统计)→DNA Model Summary Statistics(DNA模型摘要统计)，如前图T19.12所示。

这时会出现DNA Model Summary Statistics(DNA模型摘要统计)窗口，显示所有应用于当前柱状图上定义好的多周期模型。DNA Model Summary Statistics(DNA模型摘要统计)窗口中的六个模型分别对应于Multicycle(多周期)→Model to Display(要显示的模型)组中的六个模型(图T19.11)。DNA Model Summary Statistics(DNA模型摘要统计)显示在FCS Express中设置的默认统计，在稍后的教程中我们将修改这些设置。

33. 请把DNA Model Summary Statistics(DNA模型摘要统计)窗口放到DNA Cell Cycle Statistics(DNA 细胞周期统计)窗口的下方(图T19.14)。
34. 请右键点击柱状图，调出相关弹出菜单。
35. 请从弹出菜单上选中Statistics(统计)→DNA Experiment Statistics(DNA实验统计)，如前图T19.12所示。

这时会出现DNA Experiment Statistics(DNA实验统计)窗口，窗口中有对DNA模型的解释以及实验统计数据。

36. 请把DNA Experiment Statistics(DNA实验统计)窗口移到DNA Model Summary Statistics(DNA模型摘要统计)窗口的旁边(图T19.14)。

 

图T19.14  DNA Histogram with All of the MultiCycle Statistics Windows (DNA柱状图以及所有的多周期统计窗口)

图T19.14  DNA Histogram with All of the MultiCycle Statistics Windows (DNA柱状图以及所有的多周期统计窗口)

 

在下一节中，我们将执行一个使用自动拟合的扩展分析。