自动补偿 |
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要自动地调整补偿:
| 1. | 请选择Application Button(应用程序按钮)→Open Layout(打开版面)。 |
| 2. | 请打开在教程样本数据库中的AutoComp.fey文件。 |
这是我们将要用来演示如何设置自动补偿的版面(图T8.10)。最上面的密度图是应用淋巴细胞门的FSC-SSC数据。要使用自动补偿，用户需要为每一个要补偿的参数准备一个单染色的对照样本和一个未染色的对照样本。在FSC-SSC密度图下面是四个未补偿的文件: 未染色的文件、 单染色的CD3 FITC文件、单染色的CD4 PE文件以及CD3 FITC/CD4 PE双重染色文件。
图T8.10 Autocomp.fey Layout (Autocomp.fey版面)
在该例子中，我们将为FL1和FL2设置补偿。实际应用中，只要用户为每个要补偿的染色通道准备一个单染色的阴性对照，也可对多个参数进行补偿。
| 3. | 请在CD3 FITC.002绘图上创建一个包围FITC(+)细胞群的门，如图T8.11所示。如果要学习如何创建门，请参见门操作教程。 |
图T8.11 Gate on a single-stained FITC Control (在单染色的FITC对照数据上的门)
| 4. | 请在CD4 PE.003绘图上创建一个包围PE(+)细胞群的门(图T8.12)。 |
图T8.12 Gate on a single-stained PE Control (在单染色的PE对照数据上的门)
下面我们将使用刚刚创建的两个单色对照来设置补偿矩阵。
| 5. | 请选择Data(数据)→Data Info(数据信息)→Compensation(补偿)→Compensation Info(补偿信息)命令(图T8.6)。 |
这时会出现Compensation Info(补偿信息)对话框(图T8.13)。
图T8.13 Compensation Info Dialog (补偿信息对话框)
| 6. | 请在Compensation Info(补偿信息)对话框中选择Add(添加)(图T8.13)。 |
这时会出现Edit Compensation Definition(编辑补偿定义)对话框(图T8.14)。
| 7. | 请在Compensation Name(补偿名称)字段输入AutoComp 。 |
| 8. | 请在对话框的右侧点击Automatic(自动) (图T8.14)。 |
| 9. | 请从下拉列表中选择Automatic Compensation Setup Wizard(自动补偿设置向导) 。 |
图T8.14 Creating an Automatic Compensation using the Edit Compensation Definition Dialog (使用编辑补偿定义对话框来创建自动补偿)
这时会出现Compensation Wizard(补偿向导)的第一页(图T8.15)。在该页上，用户将要告诉FCS Express在整个自动补偿设置中要用哪个文件做模板。
| 10. | 请从绘图列表中选择第5个绘图(3FITC-4PE.004，图T8.15中蓝色高亮显示的绘图)。 |
图T8.15 Setting the Compensation Template (设置补偿模板)
| 11. | 请点击Next(下一步)(图T8.15)。 |
这时将出现Compensation Wizard(补偿向导)的第二步(图T8.16)。在这一页上，我们将选择要补偿的参数。
图T8.16 Selecting the Parameters to Compensate (选择补偿参数)
| 12. | 请选择FL1-H和FL2-H (图T8.16)。 |
| 13. | 请点击Next(下一步)。 |
这时将出现Compensation Wizard(补偿向导)的第三页(图T8.17)。我们将在这里告诉FCS Express使用未染色的试样文件来对FL1-H进行补偿。
图T8.17 Setting up the single-stained FL1-H Control (设置单染色的FL1-H对照)
| 14. | 请从绘图列表中选择第2个绘图(Unstained.001) (图T8.17)。 |
| 15. | 请从Gate for unstained control(未染色的阴性对照将使用的门)下拉列表中选择Lymphocytes(淋巴细胞) 门。 |
| 16. | 请点击Next(下一步) 按钮(图T8.17)。 |
这时将出现Compensation Wizard(补偿向导)的第四页(图T8.18)。我们将在这一页告诉FCS Express哪一个文件包含FL1-H对应的单染色对照。
图T8.18 Setting up the single-stained FL1-H Control (设置单染色的FL1-H对照)
| 17. | 请选择第4个绘图 (CD3FITC.002) - 单染色FITC对照。 |
| 18. | 请从Gate for single stained control(单染色对照要使用的门)下拉列表中选择FITC+ 门。 |
| 19. | 请点击Next(下一步) (图T8.18)。 |
这时将出现Compensation Wizard(补偿向导)的第五页。在此我们将告诉FCS Express为FL2-H使用哪个未染色的对照。这一页和图T8.17近似，只是在顶端我们将为FL2-H(而不是FL1-H)设置未染色对照。请参考图T8.17来为FL2-H设置未染色对照。
| 20. | 请从绘图列表中选择第2个绘图(Unstained.001) (在这个例子中，两个颜色的无染色对照相同，但用户可以为它们设置不同的对照)。 |
| 21. | 请从Gate for unstained control(针对未染色对照的门)下拉列表中选择Lymphocytes(淋巴细胞) 门。 |
| 22. | 请点击Next(下一步) 按钮。 |
这时将出现Compensation Wizard(补偿向导)的第六页(图T8.19)。我们将在这一页告诉FCS Express哪一个文件包含FL2-H对应的单染色对照。
图T8.19 Setting up the single-stained FL2-H Control (设置单染色的FL2-H对照)
| 23. | 请选择第3个绘图 (CD4PE.003) - 单染色PE对照。 |
| 24. | 请在Gate for single stained control(单染色对照应用的门)下拉列表中选择PE+  。 |
| 25. | 请点击Next(下一步) 按钮(图T8.19)。 |
这时会出现Compensation Wizard(补偿向导)的最后一页(图T8.20)。这里我们将选择使用平均数还是中间数作为溢出统计。一般来说是选择中间数。
图T8.20 Selecting the Spillover Calculation Statistic (选择溢出计算统计)
| 26. | 请点选Median(中间数)单选按钮。 |
| 27. | 请点击Finish(完成)按钮(图T8.20)。 |
这时将再次出现Edit Compensation Definition(编辑补偿定义)对话框(图T8.21)。注意到补偿矩阵的结果已经计算了出来。
图T8.21 Automatic Compensation Results (自动补偿结果)
| 28. | 请点击Edit Compensation Definition(编辑补偿定义)对话框中点击OK (图T8.21)。 |
| 29. | 请在Compensation Info(补偿信息)对话框中点击OK(图T8.22)。 |
这时带有AutoComp的Compensation Info(补偿信息)对话框将再次出现(图T8.22)。
图T8.22 Compensation Info Dialog with AutoComp (含有AutoComp的补偿信息对话框)
现在我们将把这个自动补偿值应用到3FITC-4PE双染色绘图上。
| 30. | 请右键点击3FITC-4PE绘图。 |
| 31. | 请从弹出菜单上选择Format(格式)。 |
| 32. | 请点击Overlays(叠加图层)类别选项(图T8.23)。 |
| 33. | 请从Compensation(补偿)下拉列表中选择AutoComp。 |
| 34. | 请点击OK。 |
图T8.23 Setting the Plot to use Automatic Compensation (为绘图设置自动补偿)
3FITC-4PE密度图这时应该看起来如图T8.24所示。
如果想纠正右下象限中FITC+细胞群的数字化错误，请参考前一节手动补偿中的最后一部分。
图T8.24 CD3 FITC - CD4 PE with Automatic Compensation (经过自动补偿的CD3 FITC - CD4 PE图)