柱状图减法工具 |
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柱状图减法运算允许用户从样品柱状图上减去一个阴性对照的柱状图，从而确定该柱状图的阳性百分率。该运算可用于操作单个柱状图，也可通过设置来自动操作一系列柱状图并将结果显示于统计窗口上。
若要自动进行柱状图减法运算，并在柱状图统计窗口上显示:
| • | 请确认在统计窗口上阳性百分率一栏是可见的。 |
| • | 使用 Format(格式)→Plot Options(绘图选项)→Specific Options(特定选项)命令(或在柱状图上右键点击，选择Format(格式)，再选Histogram(柱状图)→Histogram Specific Options(柱状图特定选项))。把 Control Histogram for Histogram Subtraction Statistics(柱状图减法统计的对照柱状图)设置成适当的阴性对照(见图14.1)。统计柱状图减法总是使用 Overton Subtraction(奥弗顿减法)算法(描述见下方)。 |
图 14.1 Formatting Hisotgram Specific Options Dialog (格式化柱状图特有选项对话框)
要做一个单独的柱状图运算，选择Data(数据)→Calculate(计算)→Histogram Subtraction(柱状图减法)命令，该命令会调出Histogram Subtraction(柱状图减法)窗口(见图14.2)。
图 14.2 Histogram Subtraction Window (柱状图减法窗口)
柱状图减法运算可以在任何当前打开的FCS的文件上执行。为对照柱状图和样品柱状图在选择适当的File(文件)、Parameter(参数)以及Control(对照门)或Sample Gate(样品门)。阳性百分率可由四种不同的方法算出，其中Overton Subtraction(奥弗顿减法)和Positive Difference(正向差额算法)通常是最准确的。
用来计算% Positive(阳性百分率)的方法有:
| • | Channel by channel(通道比较) |
从样品柱状图中减去对照柱状图的操作是以通道为基准的。换句话说，是从样品试样在通道N中的事件数减去对照试样在通道N中的事件数。将所有的阳性结果(即样本试样在通道N中的细胞比对照试样在通道N中的要多)相加，然后除以细胞总数来生成最后的阳性结果。
| • | X Percent(X百分率) |
在该方法中，用户需在对照细胞群的顶部设置一个边界通道值，并认为超过这个边界值的细胞为阳性。要确定边界值，在Percent(百分率)标签左边的编辑框中输入一个数值。若输入值是2，边界通道将低于对照细胞群的最高百分之二即在第98百分位。样品柱状图中高于这个值的任何细胞都会被认为是阳性的。
| • | Overton Subtraction(奥弗顿减法) |
这种减法运算类似于通道比较减法运算，只是负向差额(对照通道N中的细胞数比样品在同一通道N中的细胞数要多)会被添加到较低通道的正向差额上。在分析了所有通道后，剩余的阴性结果被设为零，而阳性结果总和除以细胞总数来生成一个阳性百分率。
| • | Positive Difference(正向差额) |
先计算样品和对照柱状图中通道N和通道N-1的细胞百分比，而后确定它们之间的差额。随着N从第1个通道移到最后一个频道，相应的差额会被一一确定。找到的最大差额将作为阳性百分率。
奥弗顿减法的结果是一个包含所有阳性细胞的柱状图叠加图层。这一叠加图层可以放在已有的柱状图上，方法是在Put Overton Output Histogram On(将奥弗顿输出柱状图放于)一项中选择该柱状图。可以把它看作是该柱状图上一个一般的叠加图层来计算它的统计数据。