Analyzing Data in Heat Maps(分析热图中的数据)
Contents
在这一节中，我们将学习如何：
| • | 在热图上创建门 |
| • | 使用细胞孔门来查看单细胞孔和多细胞孔对应的二维绘图中的事件 |
| • | 创建热图叠加图层，用以在一个图上查看多个细胞孔中的事件 |
我们将使用一个数据集，这个数据集用来查找FL2-A通道中呈阳性的细胞数(点数)。本章节，我们将使用HighContentAnalysis.fey版面、HighContent96wellData.dns数据文件(.dns是FCS Express创建的一种特殊文件格式)，这两种都可在教程样本数据库中找到。原始数据集中有96个FCS文件，这些文件来源于细胞板的采集系统数据。
| 1. | 请从HighContentAnalysis.fey版面。 |
| 2. | 选择Data(数据)标签→Organize Data Sets(组织数据集)→Data List(数据列表)命令(图T9.2). |
| 3. | 点击 symbol to Add Data Files(添加数据文件的图标) ，将数据文件添加到数据列表中。 |
| 4. | 从弹出菜单中选择DNS Data Stream Files (DNS数据流文件)在Files of type(文件类型)：列表下(图T18.17)。 |
Figure T18.17 Choosing DNS Data Stream Files
| 5. | 请来到FCS ExpressTutorial Sample Data(教程样本数据)目录中(图T18.18)。 |
Figure T18.18 Choosing the HighContent96wellData.dns file
| 6. | 选择“HighContent96wellData.dns" |
| 7. | 点击打开文件T18.18所示 |
这时这个文件会出现在数据列表中。这个文件包含从96个细胞孔中获得的、以.dns格式存储的数据。在我们插入热图之前，我们要把这些数据导入到版面中的绘图里。
| 8. | 选择Data(数据)tab→Change Data on All→Select→Select 选择高级打开数据对话框命令(图T18.18a) |
Figure T18.18a. Select Using Advanced Open Data Dialog command.
| 9. | 在生成的更改数据文件对话框中选择数据列表标签。 |
| 10. | 标亮HighContent96wellData.dns文件，然后点击OK. |
注：要实现上面这一目的，以下两种方法您可以二选其一，一种是用户可在数据列表中选择"HighCOntent96wellData.dns" 项目，另一种是点击“Change Data On All Plots(变更所有绘图上的数据)”(图T18.18b)。
Figure T18.18b - Change Data On All Plots button
| 11. | 这时绘图看起来应该如图T18.19。 |
Figure T18.19 High Content Analysis Layout after Loading HighContent96wellData.dns File
版面中的彩色点状图显示了.dns文件中的所有数据(图T18.19)。热图中有一个Live Cells(活细胞)门，2D绘图中就将仅显示这个门中的细胞。
热图中FL2-A参数对应的"热"孔显示为红色，"冷"孔显示为绿色。不同程度的热度由从红→黑→绿的过渡色代表。
要在热图中创建门。
| 12. | 请右键点击Heat Map(热图)。 |
| 13. | 从弹出菜单中选择Create Gate(创建门)→Well(细胞孔) |
| 14. | 请点击细胞盘边缘(但却在绿色选框中)的空白区域，如图T18.20所示(点击一个细胞孔将直接把该孔选为门操作的对象)。 |
Figure T18.20 Creating a Well Gate
这时会出现Editing New Well Gate(编辑新的细胞孔门)对话框(图T18.21)。
Figure T18.21 Editing a New Well Gate
| 15. | 请点击编号为H12的孔。此在其中输入“对话框将出现(图T18.21b)。 |
| 16. | 将该门命名为“Negative Control”，将门颜色变为“Green”，然后点击OK(图T18.21b)。 |
Figure T18.21b - Create New Gate window
现在我们要在该热图上创建第二个门，命名为"Experimental"。为了达到训练的目的，我们用另一种方式，如第12-16的步骤所示。
| 17. | 选择Gating(门操作)→Create Gates(创建门)→Well(细胞孔)命令(图T18.22)。 |
Figure T18.22 Selecting the Create Well Gate Command
| 18. | 然后，请直接点击A4孔。此Create New Gate (创建新门)对话框将出现(类似于图T18.21b). |
| 19. | 将该门命名为"Experimental" ，颜色选择为蓝色，然后点击OK。 |
这时的版面和门视图看起来应该如图T18.23所示。
Figure T18.23 Layout with Gate View Indicating Hierarchical Gating of the Negative Control and Experimental Gates
我们现在要创建一个柱状图叠加图层来查看不同细胞孔中的数据。
| 20. | 请把热图拖向版面中名为Histogram for Heat Map data(热图数据对应的柱状图)的绘图上(图T18.23b)。 |
Figure T18.23b - Drag&Drop action to create overlay
| 21. | 此Select Drag and Drop Action Dialog (选择拖放操作对话框)窗口将出现(图T18.23c)。 |
Figure T18.23c - Select Drag and Drop Action window
| 22. | 选中Add the files to the plot as new overlays(把文件作为新的叠加图层添加到绘图中)，然后点击OK(图T18.23c)。 |
| 23. | 请右键点击柱状图。 |
| 24. | 从弹出菜单中选择Format(格式)，然后选择Overlays(数据层)选项。 |
同一FCS Plate文件夹文件的两个数据层将显示在数据层列表中.
Figure T18.23d - Formatting Histogram for Heat Map data windows
| 25. | 请选中列表中的第一个叠加图层。. |
| 26. | 将Gate(门)变更为 "Negative Control"。 |
| 27. | 在线条选项将颜色更改为绿色 |
| 28. | 请选中列表中的第二个叠加图层。 |
| 29. | 将Gate(门)设置为"Experimental"。 |
| 29. | 在线条选项中将颜色更改为蓝色。 |
| 30. | 点击OK. |
这时的柱状图应该看起来如图T18.24所示，其中"Negative Control(阴性对照)"门中的细胞显示为绿色，"Experimental(实验)"门中的细胞显示为蓝色。
Figure T18.24 Histogram Displaying Events from Well Gates
我们现在要标记这些细胞孔门，以选中不同的细胞孔。
| 31. | 请右键点击Heat Map(热图)。 |
| 32. | 从弹出菜单中选择Edit Gate(编辑门)→Experimental(实验)选项。此Editing(编辑)细胞孔门对话框将出现，A4细胞孔同时也被高亮显示为蓝色(图T18.25)。 |
Figure T18.25 Editing the Experimental Well Gate (A4)
| 33. | 请点击细胞孔C12。 |
注意：“实验"柱状图中的数据峰有些移动，因为它显示的是新选中的门(细胞孔)中的细胞(图T18.26).
C12细胞孔的FL-2A染色不是很均匀，而那些比较"冷"的细胞孔的染色，例如G9(请点击G9来查看染色)和阴性对照有交叠。我们现在选中几个"阴性的"细胞孔，用以在柱状图上更好地查看阴性细胞群的。
Figure T18.26 Experimental Well Gate Changed to C12
| 34. | 请按下Ctrl+Z，撤销对门的修改。 |
| 35. | 请右键点击Heat Map(热图). |
| 36. | 从弹出菜单中选择Edit Gate(编辑门)→Negative Control(阴性对照)选项。 |
| 37. | 请按下Ctrl键，进行多个非连续项目的选择。 |
| 38. | 请点击细胞孔C1和F1(图T18.27)。 |
| 39. | 松开Ctrl按钮。 |
Figure T18.27 Selecting Multiple Non-consecutive Wells (C1, F1, and H12)
用户可以用这种方式选中多个位置不连续的细胞孔。注意：此时柱状图进行了相应的更新，用以显示选中的多个细胞孔(图T18.27中的C1、F1以及H12)。我们现在要用一个选框来选择多个细胞孔。
| 40. | 在细胞孔B1的右上方点击并按下鼠标不放。 |
| 41. | 向左下方拖动鼠标，选中B1-F1细胞孔。注意：此时，一个选框将出现，并显示选中了哪些细胞孔(图T18.28)。 |
Figure T18.28 Selecting Multiple Continuous Wells
| 42. | 松开鼠标，选中细胞孔。 |
也可使用选择框结合"Ctrl+点击"的方式来同时选中多个单元格Ctrl+点击
| 43. | 请按下Ctrl键。 |
| 44. | 请选中B1-F1细胞孔。 |
| 45. | 请点击G9细胞孔，将其选中(请不要松开Ctrl键。 |
| 46. | 创建一个新的选择框(请仍不要松开Ctrl键)，选中A8-A11。 |
| 47. | 松开Ctrl键。 |
| 48. | 在编辑孔的设门窗口点击Close(关闭)选项。 |
现在选中了细胞孔B1-F1、A8-A11以及G9，它们一起被显示在了柱状图中的阴性对照峰上(图T18.29)。
Figure T18.29 Multiple Well Selection
用户也可以用相同的方式，取消对细胞孔门的选择。
| 49. | 请右键点击Heat Map(热图)。 |
| 50. | 从弹出菜单中选择Edit Gate(编辑门)→Negative Control(阴性对照)选项。 |
| 51. | Ctrl+点击细胞孔A8。注意：此时，该细胞孔门已被删除。 |
| 52. | Ctrl并拖拽选择框覆盖B1-F1细胞孔。这些连在一起的细胞孔门也将被删除。 |
虽然选中细胞孔进行门操作或把细胞孔显示在柱状图和二维绘图上非常有用，但是很多用户仍想知道哪些细胞孔有较高的通道值。我们现在就来对热图进行格式化，只显示那些在某一边界值之上的细胞孔。
| 53. | 请右键点击热图。 |
| 54. | 从弹出菜单中选择Format(格式)选项。 |
| 55. | 选择Heat Map(热图)→Color Levels(颜色层次)选项。 |
| 56. | 将Style(样式)在下拉窗口更改为Threshold(阀值)如图T18.12). |
| 57. | 点击 图标在Threshold Value(阈值)选择insert a token(插入一个标识)。 |
| 58. | 双击Statistic(统计)从Insert Token(插入一个标记)对话框。 |
| 59. | 选择"Histogram for Creating Threshold Value(用来创建边界值的柱状图)"在“选择绘图”列表框中 |
| 60. | 选择Statistic(统计)对话框左侧的Create Statistic(创建统计)对话框。 |
| 61. | 设置该Gate(门)对Live Cells(活细胞)，从下拉列表中。 |
| 62. | 高亮显示Median(中间值)在Statistic(统计)列表框中 |
| 63. | 点击OK. |
| 64. | 将Below Threshold Color(边界值以下的颜色)改为黑色，请把Above Threshold Color(边界值以上的颜色)改为红色，然后点击OK. |
这时的热图应该看起来如图T18.30所示。红色细胞孔代表该细胞孔中FL2-A的荧光强度中间值高于整个细胞盘FL2-A 的荧光强度中间值。
Figure T18.30 Threshold Defined as Median Value