Setting Bead Gates and Markers(设置微球门和标记)

在本例中，我们将：

•学习如何来为微球设置门。
•学习如何把标记应用到微球的荧光信号峰上。
•设置FCS Express中通道校正的默认值。

 

1.请打开一个新的空白版面。
2.选择ChannelCalibration.001 文件，并在版面插入一个Forward 和 Side scatter dot plot(前向散射角和后向散射角的二维散点图)，文件所在位置为Tutorial Sample Data archive。要想更多地了解如何插入绘图，请参见tutorial on Inserting Plots(插入绘图)教程.
3.请在微球周围创建一个多边形门。

这个门看起来应如图T23.1中所示。要想更多地了解如何创建门，请参考Gating tutorial(门操作教程).

 

Figure T23.1  Polygonal Gate

Figure T23.1  Polygonal Gate

 

4.请用同一个文件插入一个新的柱状图。
5.请将其设置为显示FL3-H通道。
6.将微球门应用到新的柱状图上。

这时柱状图应该看起来如图T23.2所示。

 

Figure T23.2  Histogram of FL3-H with Beads Gate Applied

Figure T23.2  Histogram of FL3-H with Beads Gate Applied

 

这时，柱状图上会显示校正颗粒对应的５个荧光信号峰外加一个"空白"峰。现在，我们要在每个峰上设置一个的表示来对这些峰进行描绘。

7.选择Gating(门操作)→Create Gates(创建门)→Create Marker(创建标记)命令。
8.请把光标放在柱状图内部、最亮的峰的左边。
9.按下鼠标左键，把鼠标拖到信号峰的右边。
10.当光标在信号峰的右侧时，请松开鼠标键。请注意，不要选中信号峰后面代表双细胞的"尾巴"信号区(图T23.3中红圈所示)。

创建标识后，用户可以将标识选中，来移动标识的两段或者整个标记，也可调整标识大小。要想更多地了解如何修改标识的大小，请查看tutorial section explaining Marker to Gate Linking(把标记链接到门)章节.

请为其它四个峰，从最亮的峰到最暗的峰，重复第7步到第9步，请不要考虑和"空白"微球相关联的最低的信号峰。现在，您应该有五个标记，每个标记对应一个荧光峰，如图T23.3所示。

 

Figure T23.3  Markers M1 through M5 for the five Fluorescent Peaks (red circles indicate doublets)

Figure T23.3  Markers M1 through M5 for the five Fluorescent Peaks (red circles indicate doublets)

 

注：FCS Express默认的设置是在坐标轴上使用通道校正。因此，在设置通道校正之前需要设置一下显示微球的柱状图，让它不要使用通道校正，因为那是我们原始的对照。

11.请右键点击在FL3通道显示校正微球的柱状图，调出相关的弹出菜单。
12.从弹出菜单中选择目类别中 Format(格式)。

此时的Histogram Specific Options(柱状图特定选项)对话框将出现。

13.从Formatting(格式化)对话框左边的类别选项中中的Histogram Specific Options(柱状图特定选项)Histogram(柱状图)→Histogram Specific Options(柱状图特定选项)。

此时，Formatting(格式化)对话框中的Histogram Specific Options(柱状图特定选项)对话框会出现(图T23.4)。

14.不选中此时，Use channel calibration on axis(使用数轴通道校正)选项，如图中的光标所示(图T23.4)。
15.点击OK.

 

Figure T23.4  Formatting Dialog -- Unselecting Use channel calibration on axis

Figure T23.4  Formatting Dialog -- Unselecting Use channel calibration on axis

 

www.denovosoftware.com