设置通道校正工具 |
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在本例中，我们会:
| • | 确定通道校对中需要的变量。 |
| • | 使用在前一节中做好的微珠门以及标记来设置通道校正。 |
| • | 获取校正信息。 |
开始设置之前，我们要先阐述一下流式细胞FCS数据是如何被格式化的。一般来说，FCS文件中的第一个参数是前向散射，紧跟着的是侧向散射，然后是荧光通道按序排列，FL1、FL2、FL3等等。有些设备把参数名直接嵌入FCS文件中，用户可以在Channel Calibration(通道校正)工具中查看这些参数(参见以下的教程)。但在本节教程中使用的这个文件没有这些嵌入信息。但是我们知道"Parameter 5(第5个参数)"代表FL3，这就是我们想要校正的通道。如果不知道一个参数对应于哪个荧光通道，用户可以通过选择Data(数据)→DataInfo(数据信息)→View Header(查看文件头)命令来查看FCS的文本头信息。这时会出现一个对话框，以表格的方式显示FCS数据文件头信息中的所有参数信息。
我们现在就来设置通道校正工具。
| 1. | 请选中View(查看)→Tools(工具)→Channel Calibration(通道校正)命令(图T23.5)。 |
图T23.5 Selecting the Channel Calibration Tool Command (选择通道校正工具命令)
这时会出现Channel Calibration(通道校正)对话框(图T23.6)。
图T23.6 Channel Calibration Dialog (通道校正对话框)
| 2. | 请点击Channel Calibration(通道校正)对话框上的Add(添加)按钮(图T23.6)。 |
这时会出现一个New Calibration(新校正)对话框，类似于图T23.7。
图T23.7 New Calibration Dialog (新校正对话框)
| 3. | 请从Create calibration for(为...创建校正) 下拉列表中选中Parameter 5(第5个参数)(图T23.7)。 |
| 4. | 请从Calculate regression from(从...计算回归)下拉列表中选择有校正微珠的柱状图Histogram - ChannelCalibation.001 (FL3) 。 |
注: 如果在柱状图上有多个叠加图层，请在Overlay(叠加图层)一项中选择使用哪个图层。在本例中的柱状图只是一个简单的柱状图。因此，图上没有其它叠加图层。用户不需要在对话框上做任何修改。
| 5. | 请在Number of peaks to use for regression(回归过程中用到的信号峰的数目)字段输入"5" 。 |
一般来说最好使用所有信号峰(除去空白峰)；但如果因某种原因用户想要删除某个信号峰，也是可以的。用户必须使用最少三个信号峰来计算回归。
| 6. | 请在Molecules/Bead(分子/微珠) 列中为每个数据峰输入以下荧光值(如图T23.7): 从Marker 1(第1个标记)开始，分别为77100、22100、6900、2100以及750。 |
这些值是由微珠制造商提供的，它们常被称为MESF – Mean Equivalent of Soluble Fluorochrome(可溶性荧光染料溶解平衡值)。在本例中的MESF值是针对PE-Cy5分子的。
如果用户选择的信号峰数少于柱状图上的实际信号峰数，例如从五个峰中选四个，请保证从左边的一列中选中正确的标记。
| 7. | 请点击Calculate(计算)按钮 (图T23.7)。 |
这时New Calibration(新校正)对话框以及计算结果，也即Slope(斜率) 、Y Intercept(Y轴截距)和Correlation coefficient(拟合系数) 看起来应该如图T23.7所示。FCS Express使用对数值计算回归。最小检测阈值是在回归公式中把通道设为"1"时获得的荧光信号。级数(机器的动态范围)的计算公式为斜率的倒数。
| 8. | 请点击OK，关闭New Calibration(新校正)对话框。 |
这时出现的Channel Calibration(通道校正)对话框将如图T23.8所示。现在可以使用通道校正了。
如果用户定义了多个参数的校正，它们都会在这里出现。如果选中了Active(有效的)选项，那么在版面中将应用该校正设置(应用于那些勾选了Use channel calibration on axis(在数轴上使用通道校正)选项的绘图)。对于每一个参数用户只可以定义一个有效的校正。
图T23.8 Updated Channel Calibration Dialog (更新过的通道校正对话框)
注: 我们在这里没有演示，但用户可以通过在Channel Calibration(通道校正)列表中选中某个参数已有的校正设置，来对其进行编辑，方法是按下Edit(编辑)按钮。
| 9. | 请点击OK，关闭Channel Calibration(通道校正)对话框，返回到版面上。 |
接下来，我们将演示如何进行通道校正。