使用高涵量模块处理图像数据

在这一节中，我们将学习如何:

•	导入一个"96孔板细胞核易位实验"版面

•	查看版面，用图像绘图以及点状图查看对照细胞孔结果。

•	使用热图并以细胞板视图的方式来查看细胞的关键性参数

•	使用多个热图和数据网格来在报表中显示结果

•	为细胞核易位实验优化门设置

•	了解FCS Express 4中的"Tokens(标记)"可以如何被用在报表中

•	创建和操纵一个数据网格来显示"Cell Gallery(细胞列表)"

我们将使用位于教程样本数据库中的 "IntroToImage3.fey"版面。该版面包含了一个详细的预先设置好的模板。如果你不太熟悉FCS Express 4 Image Cytometry，请先阅读本教程中的开始使用Image Cytometry一节。

第1部分: 使用高涵量模块进行数据分析时对图像进行门操作的方法

图像细胞分析常常针对从玻片或多孔细胞板上获取的多个图像以便考察不同的实验条件、所加化学药品以及多个样本源。在多个条件下进行的细胞成像研究常常被称为"高涵量分析"。针对FCS Express的High Content Add-on(高涵量插件)可以让用户在热图上操作和查看从多个样本获取的数据。这类数据常常是从多孔细胞板(6孔到1536孔板)上获取的。热图可以把从细胞孔中测量出的细胞参数显示为一个颜色图。

因为原始数据集过大，我们在本节中提供的例子不会包括所有细胞孔对应的数据。如果你想对整个数据集进行操作，或者创建自己的数据集，请访问CellProfiler导出教程中的导出96孔格式图片一节。那节中的教程提供了一个原始数据集(一个完整的CellProfiler管道)的链接，教程中还讲解了如何在FCS Express 4 Image Cytometry中导入和查看数据。

1.	请从教程样本数据库中导入IntroToImage3.fey版面。

请确保你查看的是Experiment Design(实验设计)页面。这页包含了在一个96孔板上进行的细胞核易位实验数据。页面上一个热图以细胞板的方式，把Y-轴参数(在本例中为Intensity_IntegratedIntensity_Cytoplasm参数)以绿(低)到红(高)的颜色频谱显示出来。

在热图下方是一个细胞板图，显示了在每个细胞孔中添加的化学药品(图T28.33)。第1列包含了4个条件完全相同的阴性对照以及4个条件完全相同的阳性对照细胞孔。右上方的图像绘图显示了细胞孔A-01中的细胞质染色图像。它下方的点状图是细胞面积对综合细胞质强度作图。最左边的"Gate View(门视图)"显示了在本版面中用到的所有预先定义好的门。我们在本节教程中不会涉及到所有门，但当你想针对本版面做进一步练习时，这些门可能会很有用。

图T28.33 The Experiment Design Layout Page (实验设计版面页)

请右键点击热图。

3.	请选择Format(格式)。

4.	请选择Overlays(叠加图层)类别选项(图T28.34)。

注意到你可以通过修改Statistic parameter(统计参数)选项来选择在热图上显示的参数，你也可以通过修改Statistic to show(要显示的统计)选项来决定显示哪个统计数据。在本例中我们在绘图上显示的是所有细胞的Median(中间值)。请看一下变量选项，但请不要修改Intensity_IntegratedIntensity_Cytoplasm。

图T28.34 Format Options for Heat Map (热图格式选项)

5.	请左键点击Heat Map(热图)旁边的"+"，展开热图显示选项(图T28.35)。

图T28.35 Color Formatting Option for Heat Maps (热图颜色格式化选项)

6.	请选择Color Levels(颜色层次)类别选项。

这个类别选项让你可以设置在热图上使用的颜色方案。注意到你可以通过Selected Color Level(选中的颜色层次)下拉菜单选择颜色方案，通过Style(样式)下拉菜单选择颜色显示格式化类型；你同时可以选择以linear(线性)还是logarithmic(对数)的方式显示Color Scaling(颜色范围)。

7.	请把Selected Color Level(选中的颜色层次)改为Green-Blue(绿-蓝)。

8.	请点击OK。这时的热图应该看起来如图T28.36所示。

图T28.36 Green-Blue Scaled Heat Map (绿-蓝热图)

请右键点击热图。

10.	请从弹出菜单上选择Edit Gate(编辑门)→Single Well(单细胞孔)。

这将允许我们编辑前面创建的"单细胞孔"门。注意到在热图的A-01孔上出现一个橙色的圆圈(图T28.37a)，表明细胞孔A-01是唯一的一个"单细胞孔"门。对照一下细胞板图，你将会发现这个孔是四个阴性对照孔之一(图T28.37b)。

图T28.37a Activating Single Well Gate on Heat Map (在热图上激活单孔细胞门)

图T28.37b Compound Map For 96-Well Plate (96孔板上使用的化学试剂)

11.	请点击B-01孔(另外一个阴性对照孔)。

点击B-01孔后，你就把"单细胞孔"门改到了只包括B-01孔数据，而不再包括A-01孔数据。

注意到图像绘图和点状图都进行了相应的更新来显示B-01孔对应的图像和数据(图T28.38a)。

12.	请点击E-01孔 (阳性对照)。注意到图像绘图和点状图都进行了相应更新来显示E-01孔对应的图像和数据(图T28.38b)。

注意到E-01孔图像中的细胞核的染色浓度更高。注意到点状图分布也显示细胞质的染色也较靠近荧光强度小的区域。该结果说明荧光剂从细胞质移向了细胞核。这些在分布上的改变可以用来帮助创建门。

B-01孔(阴性对照) E-01孔(阳性对照)

图T28.38a Well B-01 (B-01孔)

图T28.38b Well E-01 (E-01孔)

选择最优化的参数

13.	请选择Choosing Parameters(选择参数)页面。

注意到在本页有三个点状图。最上面的点状图"All Cells No Gate(所有细胞，没有门)"显示所有细胞的分布，是Intensity_IntegratedIntensity_Cytoplasm对Intensity_IntegratedIntensity_DNA作图。在这一绘图上，细胞分布较为分散(图T28.39)。

图T28.39 Choosing Parameters Using a Dot Plot (使用点状图选择参数)

14.	请右键点击点状图"All Cells No Gate(所有细胞，没有门)"。

15.	请选择Format(格式)。

16.	请选择Overlays(叠加图层)类别选项。

17.	请把X Parameter(X参数)修改为Intensity_IntegratedIntensityEdge_Cytoplasm。

18.

请点击OK。

请查看下面的图T28.40。注意到该绘图是细胞板上第一列中所有细胞的分布。这对于创建门来说再好不过，因为阳性对照与阴性对照有着明显的区分。阳性对照细胞集中在绘图的原点处(图T28.40)。我们已经确定了两个参数来把阳性对照与阴性对照分离开来。在蛋白质从细胞质转移到细胞核过程中，细胞质的外缘改变最大。因此，比较细胞质外缘荧光强度与整个细胞质荧光强度的变化是蛋白质向细胞核转移的很敏锐的一个因子。我们将在本节教程剩下的部分使用一些参数的组合。

图T28.40 Choosing Alternate Parameters (选择其它的参数)

注意到下面的两个点状图(图T28.41)分别显示阳性细胞以及阴性细胞，我们看到它们有完全不同的细胞群分布特征。这些分布特征已经被用来定义门了。

图T28.41 Comparison of Distributions of Positive and Negative Control Cells (比较阳性和阴性对照细胞分布)

19.	请选择Applying Gates(应用门)页面。

注意到在图T28.42中分别显示了阳性和阴性对照孔的图像绘图，与它们对应的点状图在它们的下方。红色的Non-Translocated Cells(未发生核易位的细胞)门以及蓝色的Translocated Cells(发生了核易位的细胞)门应用在了两个点状图上。

图T28.42 Display of Gates on Dot Plots and Gated Cell in Picture Plots (点状图上的门以及图像绘图中的在门里的细胞)

请仔细看一下图像绘图，你会看到红色的细胞和蓝色的细胞在形态上非常不同。仔细看一下点状图。你会看到阳性对照与阴性对照孔的点状图都应用了Translocated Cells(发生了核易位的细胞)门以及Non-Translocated Cells(未发生核易位的细胞)门。这两个门的设置首先参考了Choosing Parameters(选择参数)页面上的分布；同时门的设置也建立在对本页上的图像绘图的考察基础上，以便确保门中的细胞有着正确的形态。图像绘图应用了后置门，把Translocated Cells(发生了核易位的细胞)以及Non-Translocated(未发生核易位的细胞)分别标记为蓝色与红色。注意到每个门中的细胞百分比都以文本框的方式显示在了绘图上。在左边的阳性对照图像绘图中有98.36%的细胞为Translocated Cells(发生了核易位的细胞)(蓝色)，只有1.64%的细胞为Non-Translocated Cells(未发生核易位的细胞)(红色)。Non-Translocated Cells(未发生核易位的细胞)门仍然有明显的细胞质边界染色，尽管它们在阳性对照细胞孔中。

在Non-Translocated(未发生核易位)的图像绘图中，66.45%的细胞在Non-Translocated(未发生核易位)门中，在图像中它们主要表现为细胞质染色，细胞核染色几乎没有。34.21%的细胞在Translocated Cells(发生了核易位)的门中。这些结果对于对照来讲都是在预期范围内的，因为驱动核易位的化学物质可以说是几乎100%有效，尽管在阴性对照中仍有自动激活核易位的现象，那里我们看到了不少的发生了核易位的细胞。使用这一选择门操作的方法，我们可以在接下来的分析中、在基于单个细胞的基础上解释阴性对照样本里的自动激活现象。分析这些亚细胞群可以帮助提高实验的质量。

注: 在本例中，Translocated Cells(发生了核易位)以及Non-Translocated(未发生核易位)门的名字既显示在了点状图上，也显示在了门中细胞的百分比附近。这在FCS Express中可以用"Tokens(标记)"很容易地做到。标记非常方便，它让你可以在文本框中插入统计信息(以及其它很多信息)；它可以放在页面上，也可以放在绘图上。标记可在版面上的很多位置上显示从版面上其它地方获取的信息。当一个门的位置改变时或者导入新的数据组时，标记的文本或数值会自动更新。我们不会在此详细讨论标记。要想更多地了解创建和使用"标记"，请查看"文本框和标记"教程，或者请查看"使用标记"部分的教程。

20.	请点击点状图上的蓝色Translocated Cells(发生了核易位)细胞门，将其选中。

21.	按住鼠标不放，请把门稍微向右移动一点(图T28.43)。

22.	当把门移动到一个选定的新位置后，请松开鼠标键。

图T28.43 Moving the Translocated Cells Gate (移动发生了核易位的细胞门)

注意到后置门已经进行了调整，根据门的新位置来显示细胞的颜色(图T28.44)。没有在任何门中的细胞不会有任何颜色。注意到所有绘图以及针对门的统计都进行了更新。注意: 你的版面也许看起来不完全像图T28.44，因为你可能没有把Translocated Cells(发生了核易位的细胞)门完全按照本例移动。

图T28.44 All Plots Update Following Repositioning of Translocated Cells Gate (所有绘图根据发生了核易位的细胞门的移动而进行了更新)

23.	请按下CTRL+Z，取消对门的移动。

第2部分: 使用数据网格来创建细胞列表视图

24.	请选择Insert Tab(插入标签卡)→General(常规)→Data Grid(数据网格) (图T28.45)。

25.	请把Data Grid(数据网格)插入版面中的空白处。

图T28.45 Inserting a Data Grid (插入数据网格)

26.	请右键点击Data Grid(数据网格)。

27.	请选择Format(格式)。这时会出现Formatting(格式化)对话框(图T28.46)。

28.	请选择Parameters to Display(要显示的参数)类别选项。

图T28.46 Selecting Parameters to Display in Data Grid (请选择要在数据网格中显示的参数)

29.	请选择单选按钮来显示"Only the items checked below(仅限在下方选中的项目)"。

30.	向下翻动到列表底部，勾选以下项目旁边的复选框: Cytoplasm(细胞质)、DNA和Well(细胞孔) (图T28.47)。

图T28.47 Configuring Parameters to Display (设置要显示的参数)

31.

请点击OK。

你现在将会看到一个数据网格，显示细胞的图像以及它们的参数信息。我们将把这一关于数据网格的设置称为包括一个"Cell Gallery(细胞列表)"显示(见图T28.48)。

图T28.48 Data Grid Configured to Display Cell Images in a Cell Gallery (数据网格被设置为在细胞列表中显示细胞图像)

32.	请点击显示细胞列表的数据网格的边缘，确保将其选中。这时会出现一个红色的边框，表示列表被选中。

33.	请选中Gating(门操作)标签卡。请观察左边的Current Gate(当前门)字段，它现在显示为"No Gate(没有门)" (图T28.49)。这表明所有8个细胞孔中的细胞都在数据网格中显示出来，没有事件被划到任何的门中。

图T28.49 Current Gate Display (当前的门显示)

34.	请在Current Gate(当前门)菜单中选中Translocated Cells(发生了核易位的细胞)门。请观察有细胞列表的数据网格进行了更新来显示那些发生了核易位的细胞。

35.	请在Current Gate(当前门)菜单中选择Non-Translocated Cells(未发生核易位的细胞)门。请观察有细胞列表的数据网格进行了更新来显示那些未发生核易位的细胞。

36.	请把Translocated Cells(发生了核易位的细胞)门从任何一个点状图上拖到有细胞列表的数据网格上。请注意观察这一操作只修改了Translocated Cells(发生了核易位的细胞)门中的细胞，结果中显示出的细胞的外形明显不同。

37.	或者，你可以针对发生了核易位或未发生核易位的细胞从点状图上把门拖到有细胞列表的数据网格上。你将看到数据网格会以相同的方式进行更新。

38.	请关闭版面，请不要保存修改。

第3部分: 使用高涵量模块来查看实验

39.	请打开教程样本数据库中的IntroToImage3.fey版面。

40.	请点击"Overall Review(整体查看)"页面。

注: 该标签卡是整个实验的一个总结。左边的热图显示了细胞板以及我们为其导入的8个细胞孔(图T28.50)。

该页上也有一个显示A-01孔对应的结果的点状图，图中有Translocated Cells(发生了核易位的细胞)以及Non-Translocated Cells(未发生核易位的细胞)门。页面上还有同一个细胞孔对应的图像绘图以及一个带有细胞列表和参数数据的数据网格，数据网格显示细胞孔中所有细胞的情况。最后，页面上还有一个Gate View(门视图)，显示所有在模板中使用的保存了的门。注意: 有一些在门视图中的门没有在本教程的例子中使用到。我们将使用这一页来对实验进行整体查看，总体看一下每个细胞孔的情况。

图T28.50 Review Page of IntroToImage3.fey layout (IntroToImage3.fey版面的查看页)

41.

请右键点击热图。

42.	请选中Edit Gate(编辑门)→Single Well(单细胞孔)，正如我们以前在教程中做过的那样。

A-01孔将显示为红色，因为A-01孔是 "Single well(单细胞孔)"门中唯一的一个孔。你现在可以点击任何一个细胞孔，所有绘图都会做相应的更新。注: 如果你点击了任何其它绘图，你将需要重复编辑门过程来修改门显示。

43.	请从A-01孔开始，向下点击其它的细胞孔，直到H-01孔为止。请观察绘图的变化。

当选中一个细胞孔时，请给版面足够的时间以便所有绘图都进行了相应更新。你将发现A-01孔到D-01孔是阴性对照，它们有较高比例的未发生核易位的细胞。注意: 在图像中，绝大多数的细胞呈现红色，说明它们未发生核易位。在点状图中你会看到一个较宽的分布，细胞分布在两个门中。在带有细胞列表的数据网格中，你会看到每个细胞在哪个门中，它们的外形与它们是否发生了核易位相互对应。

44.	请点击E-01孔到H-01孔并观察每个细胞孔对应的点状图以及图像绘图。这些是阳性对照细胞孔。

注意到主要的变化是图像中的细胞核染色为蓝色，点状图显示占主导的细胞群在阳性对照门中。带有细胞列表的数据网格显示了染色主要集中在细胞核，细胞呈现出发生了核易位的形态。在数据网格中的门显示了所有细胞基本都在阳性对照门中。用这种在一个版面页中查看整个细胞板中的数据非常方便；你可以在一个页面上看到分析结果、图像以及其它相关信息！

45.	请关闭版面，请不要保存修改。

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