在这一章节,我们将：

•在版面的绘图中导入一个.fcs格式文件。
•插入和格式化绘图。
•创建和应用门、标识及象限。
•更改我们的轴标签。

 

注意：这一教程的该章节由三个Save Points(保存点)，因此在以下保存点后，您可以保存您的进程，然后返回到这些保存点：

•Save Point #1 (Step 21)(保存点#1(第21步))
•Save Point #2 (Step 39)(保存点#2(第39步))
•Save Point #3 (Step 69, end of this section)(保存点#3(第69步，章节的最后))

 

1.选择File(文件)标签→Open(打开)。
2.请打开位于教程样本数据库中，"Immunophenotyping Tutorial" 文件夹下的Immunophenotyping Tutorial.fey版面。

版面已被保存为与任何.fcs文件不关联，因此出现的是空的绘图(图T29.1)。不关联.fey文件(版面)，在将来遇到相似实验时，能更方便的作为一个模板运用。学习更过关于版面保存的三个选项的知识。

Figure T29.1  Immunophenotyping Tutorial.fey. Note that plots appear empty because the layout is saved as "unlinked".

Figure T29.1  Immunophenotyping Tutorial.fey. Note that plots appear empty because the layout is saved as "unlinked".

首先，我们将更改Default Options(默认选项)，这样我们的.fcs文件将衍生出Stain and Name keywords(染色和名称关键字)，出现在我们的绘图坐标轴上。

3.跟着Changing Common Default Options tutorial(更改默认选项命令教程)中，Changing Axis Labels(更改坐标轴标签)章节的提示。
现在，针对.fcs文件的绘图的坐标轴上，将带有描述的关键字(与.fcs文件一起保存的)标签，然后出现在这一版面中。

 

我们现在将加载一个.fcs文件到绘图中。

4.从Ribbon版面中选择Data(数据)标签→Change Data on All Objects(修改所有对象上的数据)→Select(选择) (图T29.2number1)。
5.在出现的选择一个数据文件对话框中，导航到教程样本数据库中的 "Immunophenotyping Tutorial"文件夹 (图T29.2number2)。
Figure T29.2  Loading .fcs files into the plots

Figure T29.2  Loading .fcs files into the plots

6.在 选择一个数据文件对话框中 选择"Sample 1.fcs"(图T29.2number3)。
7.点击Open(打开)(图T29.2number4)。
现在，绘图展示的是带有预先定义好的"scatter"门和象限的Sample 1.fcs文件(图T29.3)。
注意：从.fcs文件导出的 实验关键字现在展示于版面顶端的文本框中，同样，当前Windows用户名和当前时间也被展示于其中。所有这些信息都被作为live-updating(活的－更新)标记，插入到文本框中。

Figure T29.3  2D plots after changing file

Figure T29.3  2D plots after changing file

8.在 "scatter"红色门边框内点击，并按住鼠标左键不放(图T 29.4)。
9.将"scatter"门从绘图中拖拽到其右边的空白版面处(图T29.4number1)，拖拽过程中持续按住鼠标不放。
拖拽时，在原图上你可以看到，门轮廓的影子将沿着虚线箭头移动。
Figure T29.4  Dragging and dropping the "scatter" gate out of a plot to make a new plot gated on "scatter"

Figure T29.4  Dragging and dropping the "scatter" gate out of a plot to make a new plot gated on "scatter"

10.当光标处于版面原始绘图右边空白处时，松开鼠标。
拖拽结束时，圈中该"scatter"门的新的绘图将出现(图T29.4number2)。

 

11.在新绘图的 X-坐标轴上按住鼠标左键不放。
12.选择 "CD45 V800-A" 作为参数，通过鼠标指针将其高亮显示(图T29.5)。
Figure T29.5  Changing the X-parameter of a plot

Figure T29.5  Changing the X-parameter of a plot

13.然后，请松开鼠标。
现在新绘图X-坐标轴上的参数就变成了"CD45 V800"。注意：本教程中的第3步允许Stain (CD45)和Name (V800-A)关键字出现在坐标轴上。在您参数选择的这一改变，将影响在当前FCS ExpressUser Profile(用户简况)下，所有的版面创建。

 

14.在新绘图的Y-坐标轴上 重复 第11-13步，选择“CD19 V655-A”作为新的参数。
此时绘图将如图T29.6显示一样。
Figure T29.6  Plot with X- and Y-parameters changed to CD45 V800-A vs CD19 V655-A

Figure T29.6  Plot with X- and Y-parameters changed to CD45 V800-A vs CD19 V655-A

15.从Ribbon界面选择Gating(门操作)标签→Create Gates(创建门)→Polygon(多边形门)(图T29.7)。
Figure T29.7  Selecting a gate shape from the Gating tab of the ribbon

Figure T29.7  Selecting a gate shape from the Gating tab of the ribbon

16.在右边绘图的CD45+CD19+群外围(如下图所示)每个顶点处点击一下，用以创建门(图T29.8).
Figure T29.8  Drawing a polygon gate

Figure T29.8  Drawing a polygon gate

17.通过点击您定义的第一个顶点，将门封闭完成(图T29.9number1)。
 
此时，一个对话框将出现，可在此对话框中对门名称、颜色和包含/排除属性进行定义。

 

Figure T29.9  Closing and naming a polygonal gate

Figure T29.9  Closing and naming a polygonal gate

18.请在Create a new gate name(创建一个新门的名称)处输入"B cells"(图T29.9number2)。
19.从Gate color(门颜色)下拉选择中选择bright green(鲜绿色) (图T29.9 number3)。
20.点击OK(图T29.9 number4)。
21.选择File(文件)标签→Save As(保存为)，将该版面保存为linked(相关联的) (第二个单选按钮，展示于图4.2)。在该章节之后的时间，您可以点击该页面顶端的Save Point #1来回到这一步骤。

Save Point #1 (Step 21)

Save Point #1 (Step 21)

 

我们现在将通过对左下角的"B cells"门进行gating the plot(圈中绘图)方式，来对B细胞群体的表型进行详细了解。

22.在绿色"B cells"门边框内任意地方点击鼠标左键，并按住不放(图T29.10)。
23.将该门拖拽到左下角的绘图中。拖拽时，门轮廓的影子将沿着虚线箭头移动(图T29.10number1)。
Figure T29.10  Gating a plot by dragging and dropping a gate from another plot

Figure T29.10  Gating a plot by dragging and dropping a gate from another plot

24.当左下角绘图的轮廓变为蓝色，松开鼠标左键(图T29.10number2)。
此时，左下角的绘图圈中了"B cells"，看上去如图T29.10所示number3。
注意：从Gate View(门视图)中拖拽"B cells"到接受绘图中，效果是一样的。
25.在选中左下角绘图的情况下，从Ribbon界面选择Format(格式)标签→Change(更改)→Change Plot Type (更改绘图类型) (图T29.11所示)。
Fig. T29.16  Changing plot type 

Fig. T29.16  Changing plot type 

26.点击Contour(等高线)(图T29.11)。
此时，绘图看上去与图T29.12中高亮的绘图类似。

可选操作：添加outlier dots(离群点)到Contour Plot(等高线图)中，具体操作见步骤27－32步。如不进行可选操作，直接进入第33步。

27.右键点击Contour Plots(等高线图)。
28.从关联的弹出菜单中选择Format(格式)(图T29.12,鼠标光标处)。

 

Figure T29.17  Right-clicking on a plot to reformat its appearance

Figure T29.17  Right-clicking on a plot to reformat its appearance

29.点击左边的Overlays(数据层)项目类别((图T29.13number1)。
Figure T29.18  Adding outlier dots to a contour plot

Figure T29.18  Adding outlier dots to a contour plot

30.选中Show Outliers(显示离群值)复选框(图T29.13number2)。
31.变更Outlier Dot Color(离群点颜色)为红色(图T29.13number3)。
32.点击OK(图T29.13number4)。此时，绘图看上去和图T29.13相似,右边。

 

我们现在将详细检测B-cells中IgD/IgM双阴性和IgD/IgM双阳性的表型。

33.按住象限的十字交叉点(如图T29.14所示)，将十字象限拖拽到一个合适的位置，让双阴性和双阳性群体更好的划分。
注意：如果需要，Floating Quadrants(浮动的象限)的外顶点也可调整。
Figure T29.14  Adjusting the central quadrant vertex

Figure T29.14  Adjusting the central quadrant vertex

34.右击等高线图(图T29.15)。
35.选择Convert Quads to Gates(把象限转化为门)→Upper Right(右上象限)→Convert and Link(转化并链接)(图T29.15,鼠标光标处)。
Fig. T29.15  Converting and linking the upper right quadrant to a gate

Fig. T29.15  Converting and linking the upper right quadrant to a gate

 
此时，一个对话框将出现，与图T29.9类似。

 

36.重复第18-20步，但是将门的名字命名为"double positive"，颜色选为turquoise(蓝绿色) ，用以匹配右下角的预格式化的文本表格。
37.重复第34-36步，用以Convert and Link(转化并链接)左下象限 到一个门上。
38.重复第18-20步骤，但是将门的名字命名为"double negative"，颜色选为pink(粉色) ，用以匹配右下角的预格式化的文本表格。
39.选择File(文件)标签→Save As(保存为)，将该版面保存为linked(相链接)类型 (第二个单选按钮，展示于图4.2)，或者简单的按下Ctrl + S键， 在您已经将该版面保存为linked(相链接)Save Point #1的情况下。在该章节之后的时间，您可以点击该页面顶端的Save Point #2来回到这一步骤。
Save Point #2 (Step 39)

Save Point #2 (Step 39)

 

40.在Ribbon界面选择Insert(插入)标签→1D Plots(一维绘图)→Histogram(柱状图) 图T29.16，红色轮廓)。
Figure T29.22  Selecting histogram from the Insert tab of the Ribbon

Figure T29.22  Selecting histogram from the Insert tab of the Ribbon

41.在预格式化表格上方的空白处点击鼠标左键，按住不放(图T29.17)。
42.按住光标，将柱状图拖放到合适的大小(图T29.17number1)。
注意：您版面中的任何绘图、文本框或其他对象，均可在任意时间重新设置大小。
Fig. T29.17  Inserting a histogram onto the layout

Fig. T29.17  Inserting a histogram onto the layout

43.然后，请松开鼠标。此时，一个新的柱状图将出现，与图T29.17相似number2。

 

我们现在将在柱状图上，把"double-positive" 和"double-negative" 群体叠加在一起，用以比较他们CD20的表达。

44.右击柱状图(图T29.18)。
45.在相关联的弹出窗口中选择Add Overlay(添加叠加图层)(图T29.18)。
Figure T29.18  Adding an overlay to the histogram by right clicking on the plot and choosing "Add Overlay"

Figure T29.18  Adding an overlay to the histogram by right clicking on the plot and choosing "Add Overlay"

 

46.重复第5-7步，如图T29.2，在柱状图中，将"Sample 1.fcs"添加为第二个涂层。
47.在出现的附加的对话框中点击OK(图T29.19)。
Fig. T29.19  Additional dialog box for adding overlays

Fig. T29.19  Additional dialog box for adding overlays

48.再一次右击柱状图(图T29.20)。
49.在相关联的弹出窗口中选择Format(格式)(图T29.26)。
Figure T29.20  Right-clicking on the 1D-plot to access Format options

Figure T29.20  Right-clicking on the 1D-plot to access Format options

50.选择位于左边的Overlays(数据层)选项(图29.27number1)。
Figure T29.21  Formatting histogram overlays

Figure T29.21  Formatting histogram overlays

51.在键盘上按住Ctrl(Control)键，通过点击选中两个数据层(图29.21number2)。
52.从X Parameter(X 参数)下拉列表中选择“CD20 G710-A”(图29.21number3)。
53.将Smoothing(平滑处理) 增加到5(图29.21number4)。
54.点击第一个数据层(“1-Sample 1.fcs compensate...”)，其单独被选中(图29.22number1)。
Figure T29.22  Formatting histogram overlays, continued

Figure T29.22  Formatting histogram overlays, continued

55.从Gate(门)下拉列表中选择“double positive”(图29.22number2)。
56.在Line Options(线型选项) 下，为它选择turquoise(蓝绿色)(图29.22number3)。
57.重复第54-56步，但这次是点击第二个数据层 ("2-Sample 1.fcs compensate...”)，然后选择"double negative"作为门，选择pink(粉色) 作为该门的颜色。
58.点击Preview(预览)(图29.22number4)。(注意：移动格式化窗口到一边，来更好的预览绘图中格式的改变)
此时，柱状图看上去与图T29.23相似。
Figure T29.23  Preview of gates, colors, and smoothing applied to both histogram overlays

Figure T29.23  Preview of gates, colors, and smoothing applied to both histogram overlays

可选操作：标准化该柱状图，第59-62步。如不进行可选操作，直接进入第63步。

59.扩张该柱状图， 在左边的项目类别(图T29.24number1)。
Figure T29.24  Normalizing a histogram

Figure T29.24  Normalizing a histogram

60.点击Histogram Specific Options(柱状图特定选项)(图T29.24number2)。
61.从Normalize to(标准化于)下拉列表中选择Peak Value(峰值)(图T29.24number3)。
62.选择Based on Value(基于该值)单选按钮(图T29.24number4)。
63.点击OK来关闭Formatting(格式化)窗口(图T29.25)。标准化后，该柱状图看上去类似于图T29.30,右边；如果不选择标准化，该柱状图看上去类似于图T29.29。
Figure T29.25  Clicking OK to accept the formatting changes.

Figure T29.25  Clicking OK to accept the formatting changes.

 

通过在 CD20-positive群体上创建一个标识，来查看IgD/IgM双阴性和双阳性群体中CD20表达的不同。

64.在柱状图上点击右键(图T29.26)。
65.在相关联的弹出窗口中选择Create marker(创建标识)(图T29.26)。
Figure T29.26 Right-clicking on the histogram to add a marker

Figure T29.26 Right-clicking on the histogram to add a marker

66.在阳性群体峰值的左边点击鼠标左键，并按住不放(图T29.27)。
67.移动光标，跨越该阳性峰(图T29.27number1)。
Figure T29.27  Creating a marker

Figure T29.27  Creating a marker

68.然后，松开鼠标。现在，标识("M1”)已经被添加到绘图中了(图T29.27number2)。
69. 选择File(文件)标签→Save As(保存为)，将该版面保存为 linked(相链接) (第二个单选按钮，展示于(图4.2)，或者简单的按下Ctrl + S键，在您已经将该版面保存为linked(相链接)Save Point #1 or #2情况下。在该章节之后的时间，您可以点击该页面顶端的Save Point #3来回到这一步骤.
Save Point #3 (Step 69, end of this section)

Save Point #3 (Step 69, end of this section)

 

我们现在已创建了一个带有二维绘图、柱状图、门、象限和标识的版面。下一节，我们将添加summary statistics(概要统计)到版面中。

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